¿Cómo se mide la inhibición de hongos fitopatógenos por bacterias?
Las bacterias presentes en la composta y la lombricomposta no solo participan en la degradación de la materia orgánica. Algunas también pueden limitar el desarrollo de microorganismos perjudiciales para las plantas. Para comprobar esta capacidad no basta con observar que una bacteria parece detener a un hongo: es necesario aplicar una metodología controlada que permita medir y comparar el crecimiento micelial.
En este artículo se explica detalladamente la metodología utilizada para evaluar la capacidad antagónica de bacterias del orden Bacillales aisladas de lixiviados de lombricomposta frente a diferentes hongos fitopatógenos. El estudio evaluó el efecto de cinco cepas bacterianas sobre el crecimiento de Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Alternaria solani y Rhizopus sp.
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La prueba se realizó mediante una competencia directa en cajas Petri, comparando el crecimiento del hongo en presencia de las bacterias con su crecimiento en una condición control sin bacteria.
¿Qué es una prueba de inhibición del crecimiento micelial?
Una prueba de inhibición del crecimiento micelial es un ensayo microbiológico que permite determinar si un microorganismo puede reducir el desarrollo de un hongo.
El término micelio se refiere al conjunto de filamentos, llamados hifas, que forman la estructura vegetativa de un hongo. Cuando un hongo se cultiva en una caja Petri con un medio nutritivo, su micelio se extiende radialmente sobre la superficie del agar.
En condiciones normales, el crecimiento continúa hasta ocupar una parte importante o incluso la totalidad de la caja. Sin embargo, cuando se coloca una bacteria con capacidad antagónica cerca del micelio, el crecimiento del hongo puede disminuir, cambiar de dirección o detenerse.
Esta reducción puede deberse a diferentes mecanismos, entre ellos:
- Competencia por nutrientes y espacio.
- Producción de antibióticos o metabolitos secundarios.
- Liberación de enzimas que degradan la pared celular del hongo.
- Producción de compuestos volátiles.
- Modificación del pH del medio.
- Producción de sideróforos que limitan la disponibilidad de hierro.
- Contacto directo entre la bacteria y el micelio.
La prueba utilizada permite medir el efecto general de la bacteria sobre el crecimiento del hongo, aunque por sí sola no identifica exactamente cuál de estos mecanismos está actuando.
Objetivo de la metodología
El objetivo fue determinar si las bacterias aisladas de lixiviados de lombricomposta tenían la capacidad de reducir el crecimiento micelial de hongos fitopatógenos.
Para lograrlo se compararon dos condiciones:
Tratamiento: hongo cultivado en presencia de la bacteria.
Control: hongo cultivado en las mismas condiciones, pero sin bacteria.
La diferencia entre ambas condiciones permitió calcular el porcentaje de inhibición.
Primera etapa: obtención y preparación de las bacterias
Aislamiento de bacterias formadoras de esporas
Las bacterias se obtuvieron a partir de una muestra de lixiviado de lombricomposta. Se tomó 1 mL de la muestra y se realizó una dilución 1:10 utilizando agua destilada.
La dilución fue sometida a un tratamiento térmico a 80 °C durante 15 minutos. La finalidad de este calentamiento fue seleccionar microorganismos formadores de endosporas.
Las bacterias del orden Bacillales tienen la capacidad de producir estructuras resistentes llamadas endosporas. Estas estructuras sobreviven a temperaturas que eliminan muchas bacterias no esporuladas. Por ello, el tratamiento térmico funciona como un método de selección microbiológica.
Posteriormente se inoculó una pequeña cantidad de la dilución en cajas Petri con agar nutritivo y se incubaron a 37 °C durante 48 horas. Las colonias obtenidas fueron caracterizadas mediante pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas.
Entre las bacterias identificadas se encontraron cepas de:
- Bacillus circulans.
- Bacillus badius.
- Bacillus licheniformis.
- Paenibacillus alvei.
También se utilizó una cepa de Bacillus subtilis como referencia.
Preparación del cultivo bacteriano
Antes de enfrentar las bacterias con los hongos fue necesario obtener cultivos activos y estandarizar la concentración del inóculo.
Cada cepa bacteriana fue cultivada en 10 mL de medio nutritivo líquido a 37 °C durante 48 horas.
Posteriormente se realizaron diluciones seriadas 1:10. Una dilución seriada consiste en transferir una cantidad conocida del cultivo a un volumen de diluyente para reducir progresivamente la concentración de bacterias.
- Primera dilución: 1 parte del cultivo y 9 partes de diluyente.
- Segunda dilución: 1 parte de la primera dilución y 9 partes de diluyente.
- Tercera dilución: 1 parte de la segunda dilución y 9 partes de diluyente.
Después se colocaron 5 µL de cada dilución en agar nutritivo y se incubaron durante 24 horas. Las colonias desarrolladas se contaron para calcular las unidades formadoras de colonias, expresadas como UFC/mL.
Este procedimiento permitió trabajar con una concentración bacteriana conocida y evitar que las diferencias observadas se debieran únicamente a que una caja recibió más bacterias que otra. La estandarización se realizó por triplicado para cada cepa.
Segunda etapa: preparación de los hongos
Los hongos fitopatógenos fueron aislados de frutos y hojas con signos de infección. En el estudio se trabajó con cepas de Fusarium oxysporum, Rhizopus sp. y Alternaria solani, además de una cepa de Phytophthora capsici obtenida de una colección microbiológica.
Para conocer la velocidad de desarrollo de cada hongo se colocó un fragmento de agar con micelio en una caja Petri y se midió diariamente el crecimiento radial de la colonia durante siete días.
Esta etapa es importante porque no todos los hongos crecen a la misma velocidad. Por ejemplo, Rhizopus puede cubrir rápidamente la caja Petri, mientras que otros hongos presentan un desarrollo más lento.
Si se colocara la bacteria y todos los hongos al mismo tiempo, un hongo de crecimiento rápido podría ocupar la caja antes de que la bacteria tuviera oportunidad de establecerse. Por esta razón se utilizaron tiempos de preincubación diferentes.
Tercera etapa: establecimiento de la competencia entre bacteria y hongo
Colocación del hongo
Para iniciar el ensayo se cortó un fragmento de agar de aproximadamente 1 cm³ que contenía micelio activo del hongo.
Este fragmento se colocó en una caja Petri con agar nutritivo. Después, las cajas se incubaron a 28 °C para permitir que el hongo comenzara a crecer.
Los tiempos de incubación previa fueron diferentes dependiendo de la velocidad de crecimiento del microorganismo:
Hongo | Tiempo de incubación previa |
Alternaria solani | 72 horas |
Phytophthora capsici | 48 horas |
Fusarium oxysporum | 48 horas |
Rhizopus sp. | 24 horas |
Estos tiempos permitieron que cada hongo desarrollara una colonia inicial antes de incorporar las bacterias.
Colocación de las bacterias
Una vez terminado el periodo de incubación del hongo, se identificaron tres puntos alrededor del crecimiento micelial.
Cada punto se ubicó aproximadamente a 15 mm del borde del halo de crecimiento del hongo. En esos puntos se colocaron 5 µL de una suspensión bacteriana ajustada a 1 × 10³ UFC/mL.
La ubicación de las bacterias fue fundamental. No se colocaron directamente sobre el hongo, sino a una distancia determinada del borde del micelio. Esto permitió observar cómo se comportaba el crecimiento fúngico al acercarse a las colonias bacterianas.
En una misma caja se realizaron tres puntos de inoculación bacteriana. De esta forma se obtuvieron varias observaciones dentro de cada unidad experimental.
Al mismo tiempo se prepararon cajas control con el hongo, pero sin inoculación bacteriana.
Representación simplificada de la caja Petri
Bacteria
●
● ●
Bacteria Bacteria
Hongo
crecimiento micelial
El fragmento con el hongo se encuentra en la zona central y las bacterias se colocan en tres puntos alrededor de su crecimiento.
Durante la incubación, el micelio se aproxima progresivamente a las bacterias. Si existe antagonismo, el crecimiento del hongo será menor que el observado en la caja control.
Cuarta etapa: incubación y medición
Después de incorporar las bacterias, las cajas Petri se incubaron nuevamente a 28 °C.
El crecimiento micelial se midió en tres momentos:
- A las 48 horas.
- A las 72 horas.
- A las 96 horas.
La medición se realizó desde el borde previo del crecimiento micelial hasta el punto donde se encontraba el inóculo bacteriano.
Se comparó la distancia recorrida por el hongo en las cajas de tratamiento con la distancia recorrida en las cajas control.
En el control, el hongo podía crecer sin la presencia de una bacteria competidora. En el tratamiento, su crecimiento podía verse limitado por la actividad bacteriana.
¿Por qué se hicieron mediciones en varios tiempos?
El efecto antagónico no siempre aparece inmediatamente.
Una bacteria puede necesitar tiempo para:
- Adaptarse al medio de cultivo.
- Formar una colonia.
- Producir metabolitos.
- Liberar enzimas.
- Competir por los nutrientes.
Por ello, una cepa podría mostrar poca inhibición a las 48 horas y un efecto mayor a las 72 o 96 horas.
También puede suceder lo contrario: una bacteria puede retrasar inicialmente al hongo, pero después este puede adaptarse y continuar creciendo.
Medir varios tiempos permite observar la evolución del antagonismo y no únicamente una fotografía aislada del proceso.
Número de repeticiones
El procedimiento se realizó utilizando:
- Tres cajas Petri por combinación de bacteria y hongo.
- Tres puntos de inoculación bacteriana por caja.
Esto generó un total de nueve observaciones por cada competencia.
Las repeticiones son indispensables porque el crecimiento microbiológico puede variar entre cajas, incluso cuando se preparan bajo condiciones similares.
Un resultado observado en una sola caja podría deberse a:
- Diferencias en el grosor del agar.
- Variaciones en el inóculo.
- Condensación.
- Contaminación.
- Diferencias en la edad del cultivo.
- Errores durante la medición.
Al trabajar con varias repeticiones se obtiene un valor promedio más confiable y se puede realizar un análisis estadístico.
Cálculo del porcentaje de inhibición
El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial se calcula comparando el crecimiento del control con el crecimiento observado en el tratamiento.
Inhibición del crecimiento micelial (%) = [(C – T) / C] × 100
Donde:
- C es el crecimiento micelial registrado en el control sin bacteria.
- T es el crecimiento micelial registrado en el tratamiento con bacteria.
Ejemplo del cálculo
Supongamos que el hongo creció 30 mm en la caja control y solamente 12 mm en presencia de una bacteria.
[(30 – 12) / 30] × 100 = 60 %
En este caso, la bacteria produjo una inhibición del crecimiento micelial del 60 %. Esto significa que el crecimiento del hongo fue 60 % menor que el observado en la condición sin bacteria.
¿Qué significa cada resultado?
- Un porcentaje cercano a 0 % indica que la bacteria no redujo el crecimiento del hongo.
- Un porcentaje de 20 % indica una inhibición baja.
- Un porcentaje de 40 % a 60 % muestra una inhibición moderada o importante.
- Un porcentaje superior al 60 % indica un efecto antagónico elevado bajo las condiciones del ensayo.
Sin embargo, estos valores deben interpretarse con precaución. No existe un límite universal que permita afirmar que una cepa es definitivamente un biocontrolador solo por alcanzar cierto porcentaje.
El resultado depende de:
- La especie y cepa bacteriana.
- La especie y cepa del hongo.
- El medio de cultivo.
- La temperatura.
- La concentración del inóculo.
- El tiempo de incubación.
- La distancia entre los microorganismos.
- La velocidad de crecimiento del hongo.
Por ello, los resultados solamente son comparables cuando las condiciones experimentales se mantienen constantes.
Importancia del control sin bacteria
El control es uno de los componentes más importantes de la metodología.
Sin una caja control no sería posible saber cuánto habría crecido el hongo en condiciones normales. Tampoco podría distinguirse entre una verdadera inhibición bacteriana y un crecimiento lento ocasionado por el medio, la temperatura o la condición fisiológica del hongo.
El control debe prepararse con:
- El mismo medio de cultivo.
- El mismo volumen de agar.
- La misma cantidad de micelio.
- La misma temperatura.
- El mismo tiempo de incubación.
- El mismo tipo de caja Petri.
La única diferencia debe ser la ausencia de la bacteria.
Análisis estadístico
Los porcentajes de inhibición obtenidos se evaluaron mediante un análisis de varianza, conocido como ANOVA.
Este análisis permite determinar si las diferencias observadas entre las cepas bacterianas son estadísticamente significativas o si podrían explicarse por variaciones aleatorias.
Después del ANOVA se aplicó una prueba de comparación de medias de Duncan. Esta prueba permitió identificar cuáles bacterias presentaban los porcentajes de inhibición más altos y cuáles se comportaban de manera similar.
En las tablas del estudio, las letras diferentes junto a los valores indican diferencias significativas entre los tratamientos con un nivel de significancia de p < 0.05.
Un valor de p menor a 0.05 indica que existe una probabilidad inferior al 5 % de que las diferencias observadas se deban únicamente al azar.
¿Cómo se reconoce visualmente la inhibición?
Menor crecimiento del micelio
El micelio avanza una distancia menor hacia la bacteria en comparación con el control.
Formación de una zona sin crecimiento
Puede aparecer un espacio entre la colonia bacteriana y el micelio. Este espacio suele describirse como zona o halo de inhibición.
Cambio en la dirección del crecimiento
En algunos casos, el micelio modifica su patrón de expansión y crece hacia zonas alejadas de la bacteria.
Alteraciones en el aspecto del hongo
El micelio puede presentar:
- Menor densidad.
- Cambio de color.
- Bordes irregulares.
- Menor producción de estructuras reproductivas.
- Pérdida de consistencia.
Crecimiento bacteriano sobre el micelio
En algunas interacciones, la bacteria puede crecer sobre las hifas una vez que existe contacto directo.
En el estudio se observó que algunas cepas bacterianas crecieron sobre el micelio de Rhizopus después de que una hifa aérea entró en contacto con ellas. A las 120 horas se observó una disminución considerable del micelio, aunque este comportamiento no fue incluido en el análisis principal porque no había sido contemplado inicialmente en el diseño experimental.
Este hallazgo muestra por qué la observación cualitativa también es importante, además de la medición numérica.
Principales cuidados al aplicar esta metodología
Utilizar cultivos jóvenes y activos
Las bacterias y los hongos deben encontrarse en una fase activa de crecimiento. Los cultivos viejos pueden presentar menor viabilidad y modificar los resultados.
Mantener la concentración bacteriana constante
Todas las cepas deben evaluarse con una concentración equivalente. De lo contrario, una cepa podría parecer más efectiva simplemente porque se inoculó una mayor cantidad de células.
Cortar fragmentos de micelio del mismo tamaño
El tamaño del bloque de agar debe ser uniforme. También conviene tomarlo de la periferia de una colonia activa, donde el micelio se encuentra en crecimiento.
Mantener la distancia de inoculación
La distancia entre el hongo y la bacteria debe ser igual en todas las cajas. Una bacteria colocada más cerca tendría ventaja y podría generar una inhibición aparentemente mayor.
Evitar la condensación
Las gotas de agua pueden transportar células bacterianas o esporas hacia otras zonas de la caja. Las cajas deben incubarse invertidas cuando las condiciones experimentales lo permitan.
Medir siempre en la misma dirección
La medición debe realizarse desde el borde del micelio hacia el punto bacteriano correspondiente. Cambiar la referencia entre cajas introduce errores.
Registrar fotografías
Las fotografías permiten documentar:
- La forma de la colonia.
- La zona de inhibición.
- La dirección del crecimiento.
- Los cambios de pigmentación.
- La posible invasión del micelio.
- La interacción por contacto.
Es recomendable colocar una regla o una referencia de escala en las imágenes.
¿Qué demuestra esta prueba y qué no demuestra?
Esta metodología demuestra que una bacteria tiene la capacidad de reducir el crecimiento de un hongo bajo condiciones controladas de laboratorio.
Sin embargo, no demuestra automáticamente que la bacteria funcionará de la misma manera en una planta, un cultivo agrícola o el suelo.
Una caja Petri representa un ambiente simplificado. En el suelo intervienen otros factores:
- Temperatura variable.
- Materia orgánica.
- Competencia con otros microorganismos.
- Interacción con las raíces.
- Disponibilidad de nutrientes.
- Respuesta de la planta.
- Persistencia de la bacteria.
Por ello, una cepa que presenta buenos resultados in vitro debe pasar posteriormente por otras etapas de evaluación.
Etapas posteriores para confirmar el potencial de biocontrol
Ensayo con sobrenadante
Permite determinar si la inhibición se debe a sustancias liberadas por la bacteria al medio.
Ensayo de compuestos volátiles
Evalúa si la bacteria produce sustancias gaseosas capaces de afectar al hongo sin contacto directo.
Producción de enzimas
Se puede analizar la presencia de quitinasas, glucanasas, proteasas, celulasas y liasas.
Microscopía
Permite observar daños en las hifas, como deformación, fragmentación, pérdida de contenido celular o alteraciones en la pared.
Ensayos en semillas o plántulas
Sirven para comprobar si la bacteria protege a la planta contra el fitopatógeno.
Evaluaciones en invernadero
Permiten estudiar el efecto en condiciones más cercanas al ambiente agrícola.
Ensayos de campo
Representan la etapa final para determinar si el microorganismo puede utilizarse como agente de control biológico en condiciones reales.
Resultados generales obtenidos con esta metodología
Las bacterias evaluadas mostraron comportamientos diferentes según el hongo y el tiempo de competencia.
Las cepas identificadas como Bacillus licheniformis y Bacillus badius presentaron algunos de los mejores resultados. B. licheniformis destacó particularmente frente a Fusarium oxysporum y Phytophthora capsici. En cambio, otras cepas mostraron respuestas menores o específicas para determinado hongo.
A las 96 horas, B. licheniformis presentó una inhibición elevada frente a P. capsici, mientras que las respuestas frente a Rhizopus fueron más variables. Estos resultados muestran que el antagonismo depende de la combinación específica entre bacteria y hongo, y no solamente de la especie bacteriana.
Posibles mecanismos de inhibición
Producción de quitinasas
Las quitinasas degradan la quitina, uno de los componentes de la pared celular de muchos hongos.
Producción de glucanasas
Las glucanasas degradan enlaces presentes en los glucanos de la pared celular. Este mecanismo puede ser especialmente importante frente a organismos como Phytophthora.
Secreción de metabolitos secundarios
Algunas especies de Bacillus producen compuestos como iturinas y surfactinas, que pueden alterar las membranas celulares y limitar el crecimiento de los hongos.
Competencia por nutrientes
La bacteria puede consumir rápidamente los nutrientes disponibles y reducir los recursos necesarios para el desarrollo del micelio.
Producción de sideróforos
Los sideróforos capturan hierro del medio. Al disminuir la disponibilidad de este elemento, el crecimiento del hongo puede verse afectado.
En el caso de Bacillus licheniformis, se discutió la posible participación de quitinasas, glucanasas y otros metabolitos relacionados con la degradación de componentes de la pared fúngica.
La metodología de inhibición del crecimiento micelial es una herramienta útil para seleccionar bacterias con posible capacidad de control biológico.
Su principio es sencillo: comparar cuánto crece un hongo en ausencia y en presencia de una bacteria. Sin embargo, para obtener resultados confiables es necesario controlar cuidadosamente la concentración de los inóculos, la distancia entre los microorganismos, los tiempos de incubación, la temperatura, el número de repeticiones y la forma de medir.
En este estudio, las bacterias aisladas de lixiviados de lombricomposta mostraron capacidad para reducir el crecimiento de diferentes hongos fitopatógenos. Las cepas de Bacillus licheniformis y Bacillus badius destacaron por su potencial antagónico, lo que evidencia que los sistemas de lombricompostaje pueden albergar microorganismos con funciones que van más allá de la degradación de residuos orgánicos.
No obstante, una inhibición observada en laboratorio representa solamente la primera etapa. Para considerar una bacteria como agente de biocontrol deben realizarse estudios adicionales en plantas, invernadero y campo, además de identificar los mecanismos responsables del efecto.